TFF tangentinio srauto filtravimas kartu su ultracentrifugavimu efektyviam mažų ekstraląstelinių pūslelių paruošimui

Mažos tarpląstelinės pūslelės (SEV) – tai nanomastelio pūslelės, kurias išskiria ląstelės, kuriose yra nukleorūgščių, baltymų, mažų molekulių ir kitų komponentų, ir kurios atlieka svarbų vaidmenį tarpląsteliniame ryšyje. Eksosomų-tipo mažos tarpląstelinės pūslelės yra labai panašios į savo pirmines ląsteles. Palyginti su dirbtinėmis nanodalelėmis, jos pasižymi mažesniu imuninio klirenso greičiu ir mažesniu citotoksiškumu, todėl yra perspektyvūs kandidatai kaip nauji.vaistų tiekimo in vivo transporto priemonės. Beveik visų tipų ląstelės gali išskirti šias pūsleles, o jų, kaip vaistų nešiotojų, panaudojimo tyrimai palaipsniui pereina iš laboratorijos prie klinikinių pritaikymų. Tačiaudidelio masto{0}}gamyba išlieka pagrindine kliūtimi.

 

Dabartiniai ekstraląstelinių pūslelių išskyrimo metodai

Dabartiniai ekstraląstelinių pūslelių išskyrimo metodai apimaultracentrifugavimas, tankio gradiento centrifugavimas, dydžio{0}}išskyrimo chromatografija (SEC) ir polietilenglikolio (PEG) nusodinimas.

PEG nusodinimas užtikrina didelį derlių ir paprastą veikimą, tačiau jis yra susijęs su dideliu užteršimu nepageidaujamais baltymais. Tankio gradiento centrifugavimas ir dydžio-išskyrimo chromatografija gali gauti labai-grynų produktų, tačiau jų efektyvumas yra palyginti mažas, o procesai{3}}atima daug laiko. Ultracentrifugavimas yra plačiai naudojamas, tačiau jo apdorojimo apimtį riboja centrifugos talpa, todėl sunku ją padidinti.

 

Tangentinio srauto filtravimo taikymas SEV atskyrimui

Tangentinis srauto filtravimas (TFF) jau buvo pritaikytas nanodalelių, tokių kaip liposomos ir lentivirusiniai vektoriai, atskyrimui. TFF pašaras teka tangentiškai per membranos paviršių, o tai padeda sumažinti membranos užsiteršimą ir palengvina procesą.

Kadangi mažos tarpląstelinės pūslelės paprastai svyruoja nuo30–200 nmskersmens, a0,45 μm membranos kasetėgalima pasirinkti TFF sistemoje, kad būtų pašalinti didesni baltymai ir pūslelės, o a300 kDa membranos kasetėgali būti naudojamas mažos molekulinės masės{0}}svorio baltymams pašalinti ir koncentruoti mažas tarpląstelines pūsleles, esančias auginimo terpėje.

 

Žaliavos apibūdinimas po TFF atskyrimo

Nanodalelių sekimo analizė (NTA) parodė, kad dalelių skersmenys daugiausia pasiskirstė0–250 nm.

 

 

Tačiau transmisijos elektronų mikroskopija (TEM) atskleidė didelį kiekį užterštų baltymų, o tarpląstelinių pūslelių nepastebėta. Šie rezultatai parodė, kad norint toliau išvalyti tarpląstelines pūsleles, reikalingas papildomas gryninimo etapas.

 

TFF koncentrato apibūdinimas po 100 kDa ultrafiltracijos

TFF koncentratas buvo toliau apdorotas naudojant a100 kDa ultrafiltravimo vamzdis.

NTA parodė, kad dalelių skersmuo koncentratuose, gautuose po vieno ir dviejų ultrafiltravimo raundų, daugiausia išliko0–250 nm. Tačiau du kartus atlikus ultrafiltravimą, gautų dalelių skaičius žymiai sumažėjo.

TEM analizė parodė, kad nei vieną, nei du kartus ultrafiltravimo koncentratuose nepastebėta jokių pūslelių{0} panašių struktūrų, o išliko didelis kiekis užterštų baltymų.

Todėl100 kDa ultrafiltracija negalėjo būti veiksmingai naudojama auginimo terpei išvalyti po TFF koncentracijos.

 

 

Ultracentrifugavimo būdu išgryninto TFF koncentrato apibūdinimas

NTA parodė, kad išgrynintų produktų dalelių skersmenys daugiausia pasiskirstė diapazone0–250 nm.

Svarbu tai, kad TEM aiškiai atskleidė pūsleles primenančias struktūras skirtinguose matymo laukuose. Šie rezultatai parodė, kad sukoncentravus auginimo terpę naudojant TFF,Ultracentrifugavimas gali būti naudojamas tolesniam ekstraląstelinių pūslelių atskyrimui ir gryninimui.

 

 

SEV, išskirtų iš mezenchiminių kamieninių ląstelių kondicionuotos terpės, naudojant TFF kartu su ultracentrifugavimu, apibūdinimas

NTA parodė, kad išgrynintų produktų dalelių skersmenys daugiausia pasiskirstė diapazone0–250 nm.

TEM stebėjo pūsleles{0}} panašias struktūras. Western blot analizė parodė teigiamą ekstraląstelinių pūslelių -susijusių baltymų ekspresijąCD9, CD63 ir ALIXišgrynintose tarpląstelinėse pūslelėse.

Šie rezultatai patvirtino, kad išgrynintose mažose ekstraląstelinėse pūslelėse buvo egzosomų, o tai rodo, kad šis metodas taip pat gali būti naudojamasegzosomų išskyrimas ir ekstrahavimas.

 

 

Išvada: TFF derinamas su ultracentrifugavimu, kad būtų galima kokybiškai{0}}sEV paruošti

Tyrimas parodė, kadVien TFF koncentracijagautas produktas, turintis didelį kiekį teršiančių baltymų, todėl jo nepakako kvalifikuotoms tarpląstelinėms pūslelėms gauti.

Taip pat naudojant a100 kDa ultrafiltravimo vamzdelis antriniam gryninimuiefektyviai nesukėlė nepažeistų pūslelių struktūrų.

Derinant TFF koncentraciją su vėlesniu ultracentrifugavimo gryninimu, abiejų metodų pranašumai gali būti integruoti ir gautiaukštos-kokybės mažų tarpląstelinių pūslelių produktų.

Palyginti su vien tik įprastu ultracentrifugavimu, kombinuotas procesas gali būti veiksmingassumažinti bendrą apdorojimo laiką ir pagerinti atskyrimo efektyvumą.

Šioje darbo eigojeTFF leidžia greitai praturtinti{0}}didelio tūrio pavyzdžius, sprendžiant įprasto ultracentrifugavimo apribojimus apdorojant didelius mėginių kiekius. Ultracentrifugavimas atlieka gilų gryninimą, kad pašalintų bendrai-koncentruotas baltymų priemaišas, kartu palaikydamas pūslelių grynumą ir vientisumą.

Be to, šiam procesui nereikia pridėtiegzogeniniai cheminiai nusodinimo reagentai, padedantis maksimaliai išsaugoti pūslelių biologinį aktyvumą.

Pramoninio vertimo požiūriu šis procesas yra reikšmingaspadidinti potencialą-ir gali padėti spręsti problemas, susijusias su didelio masto ekstraląstelinių pūslelių gamyba-vaistų pristatymas, regeneracinė medicina ir susijusių produktų kūrimas. Tai taip pat suteikia tvirtą eksperimentinį pagrindą tolesniam proceso optimizavimui ir bandomajai gamybai{1}}.

 

Nuoroda

Wang Ling, Li Mengshi, Xu Sha ir kt.Mažų ekstraląstelinių pūslelių atskyrimo tangentinio srauto filtravimo ir ultracentrifugavimo metodo sukūrimas. Kinijos biologijos žurnalas, 2022, 35(9): 1096–1101. DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.