300 kd tuščiavidurio pluošto ultrafiltravimas: didelio{1}}efektyvaus koncentravimo ir valymo proceso, skirto pėdos-ir -snukio ligų O/A virusui, analizė
Sep 03, 2026| Įvadas
Snukio ir nagų liga (SNL) yra ūmi, karščiuojanti ir labai užkrečiama gyvūnų liga, kurią sukelia snukio ir nagų ligos virusas (SNL). Šis virusas pažeidžia kanopinius gyvūnus, kurių daugiau nei 70 imlių rūšių. Jis plinta greitai ir turi didelį sergamumą, paprastai paveikiant pagrindinius gyvulius, tokius kaip kiaulės, avys ir galvijai, kur sergamumas gali siekti 100%. FMDV priklauso genčiaiPėdos{0}}ir-snukio virusasMicroRNAviridae šeimos. Dalelės yra sferinės, maždaug 27–30 nm skersmens, o nepažeistų viruso dalelių nusėdimo koeficientas yra 146S. Šiuo metu yra įvairių SNL vakcinų, įskaitant susilpnintas gyvų virusų vakcinas, gyvų virusų vektorių vakcinas, inaktyvuotas vakcinas, nukleorūgščių vakcinas, sintetines peptidines vakcinas ir subvienetines vakcinas. Inaktyvuotos SNL vakcinos paprastai turi mažiau šalutinių poveikių gyvūnams, o daugiavalentės vakcinos pasižymi geresniu imunizacijos veiksmingumu, todėl jos yra pagrindinė SNL prevencijos priemonė Kinijoje.
Tangentinio srauto ultrafiltracija
Šiuo metu tangentinio srauto ultrafiltravimas yra plačiai naudojamas gryninimo ir koncentravimo metodas didelio masto snukio- ir -snukio ir nagų ligos daugiavalečių inaktyvuotų vakcinų gamyboje. Šiuo metodu ne tik pasiekiamas norimas koncentracijos koeficientas, bet ir pašalinamas didelis pašalinių priemaišų kiekis. Tangentinio srauto ultrafiltravimas daugiausia naudojamas gryninimui, koncentravimui ir filtravimui (nušalinimui ir buferio pakeitimui). Be to, jis taip pat gali būti naudojamas fermentacijos sultinio arba ląstelių auginimo terpės skaidrinimui naudojant tangentinio srauto mikrofiltravimą, taip pakeičiant centrifugavimą arba pirminį skaidrinimą.
Įprasto vertikalaus filtravimo metu didelės molekulės linkusios agreguotis ant membranos paviršiaus, užkimšdamos filtrą. Tačiau tangentinis srauto filtravimas leidžia srautui eiti lygiagrečiai membranai, išvengiant šios užsikimšimo problemos. Tangentinio srauto filtravimo metu per membraną prasiskverbiantis tirpiklis ir medžiagos, mažesnės už membranos porų dydį, vadinamos permeatu, o didesnės už porų dydį medžiagos išlaikomos kaip koncentratas. Kartu su optimizuotais plovimo ir filtravimo procesais galima atskirti ir išvalyti įvairaus dydžio molekules. Ši technologija pasižymi tokiais pranašumais kaip maža kaina, švelnios eksploatavimo sąlygos, patogus valymas ir keitimas, didelis membranos prasiskverbimo srautas ir paprastas valdymas, todėl ji ypač tinka didelės apimties -koncentravimui ir biologiškai aktyvių medžiagų gryninimui.
Medžiagos ir metodai
Tuščiavidurio pluošto kolonėlė:Molekulinės masės riba 300 kd, membranos plotas 1600 cm².
Medžiagos:5,6 l O tipo ir A tipo FMDV supernatanto po centrifugavimo ir nuskaidrinimo.
Proceso parametrai:Ultrafiltravimo koncentracijos metu šlyties jėga buvo sureguliuota iki maždaug 3000⁻1, o TMP buvo kontroliuojamas taip, kad jis nebūtų didesnis nei 10 psi. Kai koncentracijos koeficientas priartėjo prie 11 kartų, mėginys buvo plaunamas 6CV buferio tirpalu. Po plovimo į įleidimo vamzdelį buvo įvestas sterilus oras, o visas koncentruotas mėginys vamzdeliuose buvo įpurškiamas į mėginio koncentracijos buteliuką. Tada buvo pridėta sterilaus PBS, kad būtų galima praplauti vamzdelius, kol galutinis koncentruoto skysčio tūris buvo 500 ml, taip pagerinant bendrą regeneravimo greitį.
Rezultatai ir diskusija
Kalbant apie pradinį viruso gryninimą, ultrafiltravimo koncentracija pasiekia daugiau nei 90 % pašalinimo greitį, kai priemaišos, pvz., baltymai, kuriuose nėra virusų. Kalbant apie tūrį, jis gali pasiekti didelę koncentraciją 10–50 kartų, todėl stipriai palaiko vėlesnį valymą. Pasirinkta tuščiavidurio pluošto kolonėlė, kurios molekulinės masės riba yra 300 kd. Šis porų dydis, išlaikant daugiau nei 85% viruso, gali pašalinti daugiau nei 90% priemaišų baltymų. Membranos plotas yra 1600 cm², o pralaidumas 2-5 ml/cm², todėl ultrafiltravimo koncentraciją galima atlikti per efektyvų laiką (per 2 valandas). Išsamūs ultrafiltravimo koncentracijos ir gryninimo duomenys pateikti 1 lentelėje.
1 lentelė. Bendro snukio - ir- nagų ligos antigenų (O ir A tipų) aptikimo rezultatai
| Pavyzdžio pavadinimas | Skystas pašaras | Tūris (ml) | 146S kiekis (ug/ml) | 146S atkūrimo rodiklis (%) | Baltymų koncentracija (ug/ml) | Baltymų pašalinimo greitis (%) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| O-tipas | Originalus sprendimas | 5600 | 2.53 | 87.94 | 5040 | 94.38 |
| O-tipas | Susikoncentruoti | 500 | 24.92 | 87.94 | 3170 | 94.38 |
| A-tipas | Originalus sprendimas | 5600 | 3.37 | 94.80 | 5980 | 93.55 |
| A-tipas | Susikoncentruoti | 500 | 35.78 | 94.80 | 4318 | 93.55 |
Apsvarstykite valymo metodą
Šiuo metu yra įvairių gryninimo metodų, tačiau net ir naudojant tą patį metodą tam pačiam antigenui, valymo efektas dažnai yra nepatenkinamas dėl daugelio priežasčių, įskaitant antigeno apibūdinimą ir proceso parametrus. Pavyzdžiui, prieš srovę vykstančios molekulinės konstrukcijos ar fermentacijos kultūros sistemų pokyčiai gali pakeisti viruso molekulinę struktūrą, todėl gryninimo rezultatai bus nepatenkinami. Netinkami nuskaidrinimo metodai gali padidinti žaliavų sąnaudas arba heterologinio baltymo kiekį, todėl gali padidėti spaudimas tolesniam valymui. Netinkama ultrafiltravimo koncentracija, pvz., skirtingi ultrafiltravimo membranos porų dydžiai, koncentracijos ir eliuavimo faktoriai, įleidimo srautas, filtravimo greitis ir TMP, gali lemti mažą antigeno atkūrimo greitį. Didelė praktika rodo, kad prastas valymas gali sukelti reikšmingų nepageidaujamų reakcijų gyvūnams po imunizacijos ir gali baigtis mirtimi.
Išvada:Šis tyrimas rodo, kad tangentinio srauto procesuose, parenkant tinkamą membranos porų dydį (300 kd), plovimo santykį, įleidimo srautą ir TMP, galima užtikrinti tiek didelį regeneravimo greitį, tiek maksimalų priemaišų pašalinimą.